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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELADEPARTAMENTO DE GENTICA

DESARROLLO DE UN MAPA GENTICO CON

MARCADORES AFLP Y MICROSATLITE EN

RODABALLO (Scophthalmus maximus L.)

Memoria presentada por:

Gloria M Gonzlez Fortespara optar al grado de Doctora en Ciencias Biolgicas

Lugo, Mayo 2008

CARMEN BOUZA FERNNDEZ, PAULINO MARTNEZ PORTELA y LAURA

SNCHEZ PIN, Profesores Titulares y Catedrtica del Departamento de

Gentica de la Universidad de Santiago de Compostela

CERTIFICAN

Que el trabajo titulado Desarrollo de un mapa gentico con marcadores AFLP

y microsatlite en rodaballo (Scophthalmus maximus L.), que presenta Gloria

M Gonzlez Fortes para optar al Grado de Doctora en Ciencias Biolgicas, ha

sido realizado bajo su direccin, que lo consideran concludo y autorizan su

presentacin al tribunal calificador.

Y para que as conste, firman la presente en Lugo, a 26 de Mayo de 2008.

Dra. Carmen Bouza Fernndez Dr. Paulino Martnez Portela

Dra. Laura Snchez Pin

Gloria M Gonzlez Fortes

Este trabajo ha sido financiado mediante el Proyecto de Investigacin

Desarrollo de un mapa gentico de ligamiento con marcadores microsatlite

en rodaballo (Scophthalmus maximus L.), (PGIDT01MAR26101PR),

concedido por la Xunta de Galicia. As mismo, su realizacin se ha visto

facilitada gracias al disfrute de una Bolsa de Tercer Ciclo y una Bolsa

Predoctoral concedidas por la Consellera de Educacin y Ordenacin

Universitaria (Direccin Xeral de Universidades e Investigacin) de la Xunta de

Galicia.

AGRADECIMIENTOS

Terminado el trabajo, queda mirar atrs, hacer un repaso e intentar no olvidar a ninguno de los que de una manera u otra me han ayudado a iniciar, desarrollar y concluir esta tesis.

En primer lugar, mi agradecimiento a mis directores de tesis, Carmen Bouza, Paulino Martnez y Laura Sanchez. Laura y Carmen confiaron en que podra llevar a cabo este proyecto y a ellas debo agradecerles el haberme iniciado en el mundo de la investigacin. Especialmente, a Paulino y Carmen, les agradezco que hayan seguido este trabajo durante los ltimos aos, que han sido duros y a veces parecieron interminables.

A Francesco Nonnis-Marzano y Gilberto Gandolfi, de la Universit degli Studi di Parma, debo agradecerles todo el trabajo relacionado con el desarrollo de marcadores AFLP, que fueron fundamentales para la elaboracin de este mapa. Les debo mucho a nivel profesional, pero ms an a nivel personal. En su laboratorio comprob que se puede disfrutar trabajando.

Gracias al Dr. Paolo Ajmone-Marsan della Universit del Sacro Coure decubr el GenomiPhi, que sirvi para rectificar los errores de principiante.

A Ania, Maria Peque y Mara Portela quiero agradecerles su compaa, los ratos de chchara y de trabajo en equipo...de ellas me llevo los mejores recuerdos del laboratorio en Lugo. Tambin a Beln y Sonia, les agradezco su profesionalidad y que en los momentos peores hayan tenido siempre una palabra de nimo. Gracias tambin a Miguel por su ayuda con el misterioso mundo de los sofwares estadsticos.

A mis compaeros en Italia tengo mucho que agradecerles. Marta Scalfi me mostr los secretos del Mapmaker, recordar siempre la tarde que pasamos a los pies de los Alpes, portatil en mano, descifrando el lenguaje de Lander et al., 1987. A Andrea y Pio, gracias por esos cafs que nos reunan a la comunidad de becarios para fregarsene di tutto. A Milena, Riccardo y Marina, siempre les agradecer el haberme recibido como una ms en su laboratorio, sin mostrar un mnimo de recelo ante la espaola que monopolizaba sus pipetas.

A mi familia le agradezco su apoyo, el que siempre estn ah y me valoren igual con tesis que sin ella. A Marco, que comenz conmigo la aventura lucense y que ha vivido de cerca los alti-bajos de estos aos, gracias por tu confianza y apoyo incondicional.

No quiero cerrar estos agradecimientos sin mencionar a mis amigas ngeles, Amalia, Eda ..., gracias a ellas los largos inviernos lucenses fueron menos fros.

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RESUMEN

Resumen

RESUMEN

A lo largo de esta memoria se presenta la construccin de un mapa

gentico en una de las especies marinas de mayor inters en la acuicultura

gallega, el rodaballo (Scophthalmus maximus). En especies de inters

comercial, la disponibilidad de un mapa gentico supone una herramienta

fundamental en la mejora de los stocks de cultivo, ya que son el primer paso en

la identificacin de QTLs (Quantitative Trait Loci) para caracteres de inters

como la resistencia a enfermedades, crecimiento o determinacin sexual. El

desarrollo de estos mapas genticos exige disponer de familias adecuadas

para el seguimiento de la segregacin gnica y de un nmero de marcadores

relativamente elevado que permitan cubrir el genoma en estudio. En el caso de

rodaballo, una especie de domesticacin relativamente reciente y poco

conocida a nivel genmico, cuando se emprendi este proyecto de mapeo, no

se dispona de familias seleccionadas y el nmero de marcadores

desarrollados era escaso. As, la seleccin de la familia de referencia para el

mapeo y la identificacin de marcadores de ADN que cubrieran

adecuadamente el genoma, marcaron gran parte del desarrollo de este trabajo

de Tesis.

En rodaballo se dispona de la tecnologa para la induccin de

ginognesis, por lo que se seleccion como familia de mapeo una hembra de

rodaballo procedente de una poblacin natural y 50 de sus embriones

ginogenticos haploides, considerando las ventajas de los individuos haploides

en cuanto al genotipado de marcadores dominantes. En una muestra de estos

embriones haploides se puso a punto, por primera vez en esta especie, la

tecnologa AFLP. A partir de la combinacin de endonucleasas EcoRI/TaqI y

de diecisiete parejas de cebadores, se identificaron 186 fragmentos

polimrficos en la familia de mapeo. Setenta y cuatro polimorfismos fueron

descartados atendiendo a criterios de calidad de la amplificacin y de ajuste a

la ratio de segregacin mendeliana 1:1 (P

Resumen

AFLP se utilizaron en el anlisis de ligamiento. Entre las bandas con ratios

distorsionadas y las descartadas por su escasa calidad, se estudi el efecto de

posibles amplificaciones inespecficas y la presencia de bandas complejas en

la induccin de errores de genotipado.

Adems de los marcadores AFLP se incluyeron en la construccin del

mapa 24 marcadores microsatlite: 22 procedentes de la literatura y 2 puestos

a punto en este trabajo a partir de una genoteca de rodaballo enriquecida en

secuencias microsatlite. El mapa resultante incluye 111 marcadores (91

AFLPs y 20 microsatlites) distribuidos en 23 grupos de ligamiento (LG) -uno

ms que el nmero de cromosomas de la especie- que abarcan un total de

1040 cM, siendo la distancia media entre marcadores adyacentes de 14,6 cM.

Los marcadores se distribuyeron aleatoriamente en el mapa, sin que pudieran

identificarse agrupaciones significativas. A partir de los marcadores framework

se obtuvo una primera estima del tamao genmico total de rodaballo, que

sera de 1150 cM.

A pesar de las limitaciones de un mapa de moderada densidad como el

presentado en este estudio, sus grupos de ligamiento proporcionan un primer

marco de organizacin del genoma de rodaballo, dibujando los primeros

bocetos de los cromosomas fsicos subyacentes al mapa gentico. La

amplificacin de los marcadores AFLP y microsatlite de este estudio en

nuevas familias segregantes junto con nuevos marcadores permitir el anclaje

a grupos de ligamiento de mapas genticos futuros hasta consolidar un mapa

genmico de referencia en esta especie.

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Resumen

SUMMARY

This work reports the construction of the genetic map for one of the

most important marine species in the Galician aquaculture, the turbot

(Scophthalmus maximus). In species with commercial value, the availability of a

genetic maps is an important tool for breeding, as it is the first sptep for QTL

(Quantitative Trait Loci) identification of traits of productive interest, such as

disease resistant loci. The construction of genetics maps needs appropriate

families to follow the genetic marker segregation, and a relative high number of

markers to cover the genome under study. In the case of turbot, a species of

recent domestication and with a low knowledge about its genome, at the

beginning of the present mapping project, there was a lack of selected families

for linkage analysis and the number of available markers was low. Thus, the

selection of the reference family for mapping and the identification of DNA

markers for an appropriate coverage of the turbot genome were major

underlying specific objectives to the development of this PhD work.

Using the available technology for gynogenesis induction in this species,

a turbot female from a wild population and its progeny of 50 gynogenetic

embryos were selected as family mapping, taking into account the advantages

of the haploid individuals for dominant markers genotyping. In a sample of

these embryos, the AFLP technology was applied for the first ti